1552年，李时珍开始搜集材料，为编著《本草纲目》作准备。李时珍编著《本草纲目》，以宋代唐慎微《证类本草》为蓝本，集唐、宋诸家本草之精萃，益金、元、明各家药藉之不足、继承我国本草研究的传统，独辟蹊径，把本草学推向一个新的高峰。
李时珍的学术思想和研究方法很有特色，达到一个新水平。他在新的历史条件下，以自己的实践经验为基础，改善了古代科学方法，积累了科学研究的新经验。李时珍成功地运用了观察和实验、比较和分类、分析和综合、批判继承和历史考证方法。
观察和试验是本草药研究的基本方法。李时珍对药物采用亲自采集、仔细观察，以得其真的方法，获得很大成功。分类是科学研究的重要任务，分类使药物研究体系化，关键还是如何确立分类的标准。李时珍打破本草学沿用已久的上中下三品分类法，建立了三界十六部分类法，使分类体系更为科学化。
除三界十六部分类法，他还在陶弘景主治药分类法基础上，建立了更完善的百病主治药分类法，创立了药物归经分类法。
李时珍为弄清每味药物，提出释名、集解、辨疑、正误、修治、气味、主治、发明、附方八项任务，这八项不是每味药全有，有的五项、六项不等。实际上是对每味药既作出系统分析，又进行了全面综合，而在分析基础上，又作了高度概括和综合。
批判继承和调查研究是李时珍研究的重要方法。他研究每味药，总是先参考诸家本草，考核诸家异同，用自己观察试验结果，加以参证：《本草经》中只载枸杞之名，未言明药用部位；《名医别录》指出根大寒，子微寒；《药性论》谓枸杞甘平、子、叶皆同，《本草衍义》说枸杞是梗皮，李时珍说：“窃谓枸杞：苗、叶，味苦甘而气凉；根，味淡气寒；子，味甘气平，气味既殊，则功用当别。此后人发前人未到之处也”。李时珍经过研究，在批判继承的基础上，推陈出新，“发前人未到之处”，这种精神，贯穿于他的全部研究活动中。
李时珍躬亲实践，广泛向劳动人民学习，注意调查研究，是他又一重要研究方法。莶一药，众说纷坛，有谓似酸浆，有说为苍耳，有曰即地菘；李时珍经过广泛征询，聚诸草谛视，得出莶即猪膏母之确论，他从京师还，见车夫用旋复花治跌打损伤，遂肯定其益气续筋，补劳损之功。邻家小儿食积，偶取羊食之，归而大吐愈，李时珍因此首载此品种入本草。他从猎户口中知虎骨强志壮神之功能；从菜农处明确芸苔即油菜，从工人处学得防止采矿中毒之法，山人、渔翁、农夫、皮匠、猎户，都是他的老师，使他从调查研究中获益非浅。
历史考证方法是李时珍常用的科学方法。通过文献考柬，《本草纲目》中记载了来自天竺、大食、南洋、胡人、蕃人及由梵文、佛经中得到的医药知识。经过历史考证，指出“按《本经》胡麻亦名巨胜，《抱朴子》云，巨胜一名胡麻，以黄麻于及大藜子伪为胡麻，误而又误矣，不可不辨”。
